Estudio Ambystoma...

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ESTUDIO:
Caracterización molecular y conservación de especies en extinción por epidemias víricas (iridovirus) y fúngicas (quitridiomicosis) de Ambystoma (Amphibia: Caudata), un recurso de importancia local para comunidades indígenas en México

Estudio llevado a cabo por el Instituto de Biología de la UNAM a través de
la Dra. Gabriela Parra Olea y M.C. Nohemí Matías Ferrer


OBJETIVO GENERAL: Este proyecto se centra en la caracterización molecular de las poblaciones de Ambystoma de interés económico a escala local en México afectadas o susceptibles de ser atacadas por virosis y quitridiomicosis infectiva. Se incluye la identificación de las poblaciones más afines genéticamente para ser utilizadas como fuente de ejemplares para reintroducción cuando ésto sea posible, la detección de los patógenos (iridovirus y quitridios) mediante técnicas de PCR y elaboración de modelos predictivos con información genética que permitan determinar cuáles son las poblaciones con mayor riesgo.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
En este proyecto se proponen tres líneas de actuación cuyos objetivos y antecedentes se desglosan a continuación:
(1) Caracterización molecular de las poblaciones de Ambystoma afectadas e identificación de las poblaciones más afines genéticamente para ser utilizadas como fuente de ejemplares para reintroducción cuando ésto sea posible.
(2) Detección de los patógenos (iridovirus y quitridios) mediante técnicas de PCR y elaboración de modelos predictivos con información genética que permitan determinar cuáles son las poblaciones con mayor riesgo de ser afectadas.
(3) Evaluación del estado de conservación de las especies amenazadas por virosis y quitridiomicosis.

BREVE DESCRIPCIÓN:
La biología singular de las especies de Ambystoma mexicanas, unas permanentemente acuáticas y otras con una etapa terrestre, y la restricción del área geográfica de las diferentes especies, algunas endémicas de un único lago y sus afluentes immediatos (A. dumerili, A. andersoni), no permite generalizar las conclusiones obtenidas en otras especies o en otras zonas geográficas, dado que diferentes especies (neotenicas vs. metamorficas) han estado bajo diferente presiones de selección, ya sea evolutivas o aquellas inducidas por el hombre (introduccion de especies exóticas, sobreexplotación etc.). Las especies de Ambystoma sobre todo aquellas que son neotenicas (A. dumerilii, A. andersoni y A. mexicanum) han sido una fuente de recursos para las poblaciones locales de México, tanto como fuente de recursos económicos asi como fuente alimenticia.


		Durante las últimas decadas, las poblaciones de Ambystoma han sufrido una alarmante disminución en su tamaño poblacional, y las que anteriormente eran extremedamente abundates hoy en dia son escasas y se cuestiona la posibilidad de su extinción en un plazo corto de tiempo. No solo la obvia disminución en el tamaño poblacional es alarmante, si no que también en aquellos casos en los que se cuenta con poblaciones en laboratorio (por ej. A. dumerilii en el laboratorio de la Dra. Dolores Huacuz, en la Universidad Michoacana), las salamandras mueren cotidianamente y la causa de la muerte es desconocida. En el presente proyecto se proponen, como se mencionó anteriormente tres líneas de investigación, las cuales se desglosan a continuación:

Caracterización molecular de las poblaciones de Ambystoma afectadas e identificación de las poblaciones más afines genéticamente para ser utilizadas como fuente de ejemplares para reintroducción.

Mi propuesta incluye la realización de un análisis mitocondrial inicial, utilizando genes de evolución relativamente lenta para el caso que nos ocupa como ND4 y Cytb con objeto de identificar los niveles de divergencia generales entre las especies y poblaciones de Ambystoma de México. Estos marcadores han resultado de gran utilidad en otros grupos de slamandras mexicanas (Parra Olea et al., 2000, 2001). Una vez estimada la divergencia entre especies y dentro de éstas entre poblaciones, se seleccionarán aquellas de mayor interés atendiendo a los siguientes criterios: singularidad genética y biológica, interés económico y grado de amenaza. En el caso de las especies y poblaciones seleccionadas (al menos las 15 más importantes) se procederá a un análisis genético poblacional basado en la utilización de microsatélites. La utilización de microsatélites permite conocer la estructura genética de las poblaciones incluyendo una estimación de la variabilidad genética real e identificar la existencia de flujo génico entre poblaciones cercanas. La obtención de las secuencias cebadoras (primers) necesarias para la realización de este proyecto se obtendran de la compañía "Genetic Identification services" ya que garantizan un resultado adecuado en poco tiempo. Para estos análisis se utilizarán unas 20 muestras por población principal y series de 10 muestras de las poblaciones próximas.

En las especies de salamandras estudiadas por nosotros en México se han encontrado grandes diferencias genéticas entre poblaciones geográficamente muy próximas (García Paris et al., 2000) por lo que la traslocación e introducción de ejemplares de otras poblaciones en las ya amenazadas podría suponer un riesgo adicional por contaminacióngenética. Para paliar este efecto en este proyecto se analizarán poblaciones próximas a las poblaciones amenazadas indicándose la posibilidad de efectuar una reintroducción controlada cuando la similitud genética entre ambas lo permita. Todos estos análisis basados en la secuenciación de ADN vía PCR tienen la ventaja adicional de que no requieren el sacrificio de ejemplares y que además ya ha sido utilizada por mi equipo en proyectos anteriores.

Detección de los patógenos (iridovirus y quitridios) mediante técnicas de PCR y elaboración de modelos predictivos con información genética que permitan determinar cuáles son las poblaciones con mayor riesgo de ser afectadas


		Por otro lado, dada la rapidez con que estos modelos pueden generarse, una vez concluida la fase de toma de datos, las conclusiones que aporten pueden motivar rápidas actuaciones de conservación centradas en las poblaciones o especies susceptibles de presentar problemas de conservación a corto o medio plazo. Estos modelos matemáticos están basados en análisis multivariantes del tipo "multidimensional scaling (MDS)", y se basan en la combinación de caracteres ecológicos, fisiológicos, genéticos, morfológicos, etc. Algunos caracteres ecológicos especialmente útiles y no demasiado costosos de obtener son por ejemplo el tipo y el uso del hábitat, la actividad temporal, las características del microhábitat, la distribución espacial, etc.

Otros caracteres fisiológicos susceptibles de ser usados aquí son el tipo de reproducción, el tamaño de la puesta, la duración de las fases larvarias o del período hasta alcanzar la madurez sexual, etc. Además, algunos caracteres morfológicos como el tamaño corporal, o caracteres biogeográficos o corológicos pueden sustentar gran peso en el modelo. Por último, algunos caracteres genéticos, como la distancia genética entre las poblaciones estudiadas, son relevantes para evaluar correctamente la importancia de estas poblaciones y el grado de sus posibles amenazas. Por último señalar que, en el caso particular que nos ocupa, al permanecer aún sin resolver el problema del mecanismo implicado en la aparición o transmisión de las infecciones fúngicas, estos modelos podrían ser especialmente útiles analizando los resultados generados en este proyecto en el contexto de otras poblaciones y especies afectadas en otros lugares del mundo.

Evaluación del estado de conservación de las especies y poblaciones amenazadas por virosis y quitridiomicosis.
Mi objetivo es controlar y seguir el desarrollo y avance de la epidemia, con objeto de evaluar los daños que produce en nuevas poblaciones afectadas.


Para ello se integrarán los resultados obtenidos en los objetivos anteriores. En particular el interés de mi equipo se centra en el seguimiento de poblaciones clave correspondientes a Ambystoma dumerili (el achoque de Pátzcuaro), Ambystoma andersoni (achoque de Zacapu) y Ambystoma mexicanum (ajolote de Xochimilco y Chalco) durante el periodo de tres años para el que se solicita el proyecto. Para ello se comparará la estructura genética obtenida a partir de los ejemplares adultos capturados el primer año, con la estructura que resultaría del análisis de los ejemplares immaduros capturados el tercer año. Con esta estrategia se obtendría una estimación de la posible pérdida de variantes alélicas en un periodo de tiempo muy corto.

Si las epidemias, en combinación con otros factores ambientales siguen actuando (ver Huacuz, 2000), la disminución de las poblaciones sería tan evidente que el descenso en el número de reproductores podría notarse en la composición genética de la población a corto plazo.

Como resultados adicionales de esta línea se presentarán informes sobre el tipo de medidas de prevención necesarias para paliar en la medida de lo posible los efectos de la epidemia, y las posibles medidas de actuación para recuperar las poblaciones en vías de desaparición.

JUSTIFICACIÓN:
La biología singular de las especies de Ambystoma mexicanas, unas permanentemente acuáticas y otras con una etapa terrestre, y la restricción del área geográfica de las diferentes especies, algunas endémicas de un único lago y sus afluentes immediatos (A. dumerili, A. andersoni), no permite generalizar las conclusiones obtenidas en otras especies o en otras zonas geográficas, dado que diferentes especies (neotenicas vs. metamorficas) han estado bajo diferente presiones de selección, ya sea evolutivas o aquellas inducidas por el hombre (introduccion de especies exóticas, sobreexplotación etc.). Las especies de Ambystoma sobre todo aquellas que son neotenicas (A. dumerilii, A. andersoni y A. mexicanum) han sido una fuente de recursos para las poblaciones locales de México, tanto como fuente de recursos económicos asi como fuente alimenticia.


		Durante las últimas decadas, las poblaciones de Ambystoma han sufrido una alarmante disminución en su tamaño poblacional, y las que anteriormente eran extremedamente abundates hoy en dia son escasas y se cuestiona la posibilidad de su extinción en un plazo corto de tiempo. No solo la obvia disminución en el tamaño poblacional es alarmante, si no que también en aquellos casos en los que se cuenta con poblaciones en laboratorio (por ej. A. dumerilii en el laboratorio de la Dra. Dolores Huacuz, en la Universidad Michoacana), las salamandras mueren cotidianamente y la causa de la muerte es desconocida. En el presente proyecto se proponen, como se mencionó anteriormente tres líneas de investigación, las cuales se desglosan a continuación:

Para paliar este efecto en este proyecto se analizarán poblaciones próximas a las poblaciones amenazadas indicándose la posibilidad de efectuar una reintroducción controlada cuando la similitud genética entre ambas lo permita. Todos estos análisis basados en la secuenciación de ADN vía PCR tienen la ventaja adicional de que no requieren el sacrificio de ejemplares y que además ya ha sido utilizada por mi equipo en proyectos anteriores. Detección de los patógenos (iridovirus y quitridios) mediante técnicas de PCR y elaboración de modelos predictivos con información genética que permitan determinar cuáles son las poblaciones con mayor riesgo de ser afectadas

La identificación de los agentes patógenos causantes de la muerte de los ejemplares de Ambystoma es posible mediante la utilización de técnicas moleculares vía PCR y de histoquímica (Berger et al., 1998, Daszak, et al., 1999, Mao et al., 1997). Para ello se tomarán muestras de piel y otras áreas susceptibles de infección de 10 ejemplares aparentemente sanos por población y de los ejemplares observados con síntomas de infección para su procesado en el laboratorio. Además en casos dudosos se utilizarán técnicas como microscopía electrónica de barrido (SEM) y técnicas de estudio histológico convencionales, para la detección de esporangios y tubos de descarga de esporas que permiten un diagnóstico inequívoco del ataque de quitridiomicetos (Berger et al., 1999). La elaboración de modelos matemáticos para la predicción del riesgo de supervivencia de una población o especie frente a amenazas conocidas es una herramienta especialmente útil y de bajo coste. Además, estos modelos pueden ayudarnos a determinar los factores que producen extinciones o declives en poblaciones para las que aún no conocemos cual es el agente implicado. Por otro lado, dada la rapidez con que estos modelos pueden generarse, una vez concluida la fase de toma de datos, las conclusiones que aporten pueden motivar rápidas actuaciones de conservación centradas en las poblaciones o especies susceptibles de presentar problemas de conservación a corto o medio plazo. Estos modelos matemáticos están basados en análisis multivariantes del tipo "multidimensional scaling (MDS)", y se basan en la combinación de caracteres ecológicos, fisiológicos, genéticos, morfológicos, etc. Algunos caracteres ecológicos especialmente útiles y no demasiado costosos de obtener son por ejemplo el tipo y el uso del hábitat, la actividad temporal, las características del microhábitat, la distribución espacial, etc. Otros caracteres fisiológicos susceptibles de ser usados aquí son el tipo de reproducción, el tamaño de la puesta, la duración de las fases larvarias o del período hasta alcanzar la madurez sexual, etc. Además, algunos caracteres morfológicos como el tamaño corporal, o caracteres biogeográficos o corológicos pueden sustentar gran peso en el modelo. Por último, algunos caracteres genéticos, como la distancia genética entre las poblaciones estudiadas, son relevantes para evaluar correctamente la importancia de estas poblaciones y el grado de sus posibles amenazas. Por último señalar que, en el caso particular que nos ocupa, al permanecer aún sin resolver el problema del mecanismo implicado en la aparición o transmisión de las infecciones fúngicas, estos modelos podrían ser especialmente útiles analizando los resultados generados en este proyecto en el contexto de otras poblaciones y especies afectadas en otros lugares del mundo.


		Evaluación del estado de conservación de las especies y poblaciones amenazadas por virosis y quitridiomicosis Mi objetivo es controlar y seguir el desarrollo y avance de la epidemia, con objeto de evaluar los daños que produce en nuevas poblaciones afectadas. Para ello se integrarán los resultados obtenidos en los objetivos anteriores. En particular el interés de mi equipo se centra en el seguimiento de poblaciones clave correspondientes a Ambystoma dumerili (el achoque de Pátzcuaro), Ambystoma andersoni (achoque de Zacapu) y Ambystoma mexicanum (ajolote de Xochimilco y Chalco) durante el periodo de tres años para el que se solicita el proyecto.

Para ello se comparará la estructura genética obtenida a partir de los ejemplares adultos capturados el primer año, con la estructura que resultaría del análisis de los ejemplares immaduros capturados el tercer año. Con esta estrategia se obtendría una estimación de la posible pérdida de variantes alélicas en un periodo de tiempo muy corto. Además del interés de los aspectos puramente científicos de este proyecto, entre los que destacaría la utilización de una metodología original, como es el análisis de marcadores moleculares con tasas de evolución diferentes para la resolución de problemas evolutivos fundamentales como el origen de la diversificación filética y específica, y la importancia del conocimiento de la estructura poblaciones para la conservación de especies en peligro de extinción, considero que el proyecto tiene utilidad adicional en dos niveles diferenciados.
En el ámbito nacional y local los resultados del proyecto son necesarios a la hora de establecer programas de conservación de las especies endémicas de vertebrados de uso tradicional en economías locales. Los resultados de este proyecto son relevantes en los niveles siguientes:

1- Contribución al mantenimiento de un recurso renovable de utilización tradicional en comunidades indígenas e identificación de la influencia de las enfermedades víricas y fúngicas en la desaparición de las poblaciones. Este es un factor extraordinariamente importante, ya que en la actualidad las razones de la disminución de las poblaciones se buscan en la sobreexplotación y en la incidencia de especies foráneas. por lo tanto todas las medidas encaminadas a la conservación de las poblaciones se centran en estos aspectos, pero si la causa principal de mortalidad son este tipo de enfermedades, como se ha demostrado en otras regiones del Planeta, entonces las medidas a adoptar requieren un plateamiento totalmente diferente. La emergencia de estas enfermedades podría responder al efecto del estrés en las poblaciones consecuencia de cambios ambientales poco considerados (ligeros incrementos en la contaminación, cambios en la temperatura del agua...) y por lo tanto las líneas de actuación han de ser claramente diferentes.

2- Caracterización genética de especies en peligro endémicas de México. Las especies crípticas a nivel morfológico, y aquellas que poseen morfología extremadamente variable a nivel local, como es el caso que nos ocupa, sólo son identificables mediante la utilización de caracteres moleculares. El desarrollo de unos marcadores apropiados que permitan identificar con precisión, con un gasto mínimo y sin sacrifico de los ejemplares, es absolutamente necesario para cualquier estudio posterior, desde cuestiones básicas como el establecimiento de los límites de distribución hasta la resolución de problemas de conservación a nivel general. En este proyecto pondremos en ejecución una batería de marcadores desarrollados por nosotros mismos en los grupos de estudio, que permitirán con un coste mínimo económico y de individuos identificar a nivel genético las especies crípticas en estudio.

Los resultados de este estudio permitirán además corroborar o cuestionar las hipótesis taxonómicas propuestas con anterioridad, esta vez con una sólida base evolutiva.

3- Delimitación de áreas de distribución. La situación de desconocimiento actual sobre la distribución de algunas de las especies de este estudio, por ejemplo la del caso de Ambystoma lermaense, A. altamirani y A. velasci.,es debida a la práctica imposibilidad de identificación basada en caracteres morfológicos, debido a la enorme plasticidad fenotípica interpoblacional. Sin estos datos resulta impracticable por ejemplo desarrollar una política de conservación adecuada para A. lermaense, una especie endémica del centro de México que podría estar ya extinguida a no ser que las poblaciones de áreas próximas hasta ahora adscritas a otras especies correspondan en realidad a A. lermaense. La identificación de las zonas de contacto entre especies requiere el establecimiento de los límites de distribución de las especies indicadas.
En una escala geográfica supranacional nuestro estudio es especialmente relevante a la hora de defender en ámbitos de conservación la singularidad de la fauna mexicana frente a la de otros paises. Y ello no sólo por tratarse de una fauna particularmente diversa y altamente diferenciada a nivel genético sino que además posee un extraordinario valor científico, ya que muchos de los procesos que aquí estudiamos únicamente tienen lugar en situaciones particulares que sólo se encuentran raramente, como es el caso de la singularidad de las poblaciones que retienen caracteres larvarios permanentemente en Ambystoma.